反相高效液相色譜法測定化妝品中的24種防腐劑
點擊: 次 時間:2017-04-05 10:43
建立了同時檢測化妝品中24種防腐劑含量的反相高效液相色譜法(RP2HPLC)。采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,以磷酸鹽緩沖溶液(pH=4.26)為流動相,梯度洗脫。樣品經甲醇超聲提取,然后采用RP2HPLC2二極管陣列檢測法測定,對樣品前處理和色譜條件進行研究和優化。方法的相對標準偏差為1.3%～3.3%;回收率為90.6%～97.8%;各種防腐劑的線性相關系數≥0.9997,具有較高的準確度和精密度,可用于化妝品中24種防腐劑含量的分析。
關鍵詞:反相高效液相色譜,化妝品,防腐劑
1引言
化妝品中的防腐劑是為了使化妝品在生產、使用和保存過程中免受微生物污染的一類化妝品添加劑。但大多數防腐劑對人的皮膚會產生不同程度的刺激。因此,化妝品中防腐劑的用量必須以安全性作為前提。我國《化妝品衛生規范》對化妝品中防腐劑的使用濃度和范圍做了相關的規定。目前,國內外對化妝品中防腐劑的測定一般多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質譜法、膠束電動色譜法、毛細管電泳法和伏安法等,而同時測定的防腐劑一般僅為4～8種,最多可同時測定18種,采用的方法均為氣相色譜-質譜法。
本實驗研究了化妝品中的24種常用防腐劑的樣品前處理方法和HPLC分離條件,建立了化妝品中24種常用防腐劑同時檢測的HPLC法。結果表明,本方法簡便、快速、準確,應用于實際化妝品中防腐劑的測定,結果滿意。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀,由四元低壓泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器及自動進樣器組成。
對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、水楊酸、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丁酯及2-芐基-4-氯酚(東京化成工業株式會社);苯甲酸、山梨酸(國家標準物質中心)。乙腈為色譜純,甲醇為優級純;無水乙醇、四氫呋喃等試劑均為國產分析純;Millipore超純水。
2.2標準品混合溶液和供試品溶液的制備
分別準確稱取一定量的24種防腐劑標準品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的標準儲備液。分別移取一定體積的上述標準儲備液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合標準儲備液。準確稱取化妝品0.2g(精確到0.001g)于50mL錐形瓶中,加入10mL甲醇,超聲提取30min,取部分溶液放入離心管中,在離心機上以5000r/min高速離心10min后,取上清液經0.22μm濾膜過濾,濾液供RP-HPLC檢測。
2.3色譜條件
色譜柱:伊利特KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。線性梯度洗脫條件見表1。流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:程序可變波長掃描;進樣量:10μL。
3結果與討論
3.1流動相的選擇
3.1.1緩沖溶液pH的選擇在24種防腐劑中,受pH影響的只有苯甲酸、山梨酸和水楊酸。因此,著重考察了不同pH值(2.5～5.5)對以上3種酸分離情況的影響。發現在pH4.26時,苯甲酸、山梨酸和水楊酸能與溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和對羥基苯甲酸甲酯達到很好的分離,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4濃度的選擇在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液對分離的影響后,發現0.025mol/LNaH2PO4可達到較好的分離,且峰形良好。
3.2檢測波長的選擇
通過全波長掃描可得到24種物質各自的吸收圖譜。綜合各物質在不同波長下的響應值和不同波長對基線的影響,最終確定采用程序可變波長進行掃描,即根據不同組分的出峰順序,在不同時間段,分別用各組分的最佳吸收波長進行檢測,從而提高檢測的靈敏度,達到最佳的掃描效果。
3.3樣品提取方法的選擇
3.3.1樣品提取溶劑的選擇在相同的色譜條件下,比較了甲醇、乙醇、四氫呋喃和流動相等4種溶劑對不同種類化妝品(膏霜類、水類、固體類)的提取效果。結果表明,乙醇和四氫呋喃提取后的色譜圖在2.0～4.5min的色譜峰的峰形欠佳,無法準確計算溴硝丙醇和水楊酸的含量,而流動相提取口紅時,不能將口紅完全溶解,且在28.26min時基線干擾較大,影響被測物質含量的測定。從提取結果可看出,乙醇、四氫呋喃和流動相對某些物質的提取率偏低,而甲醇對各物質的提取率都較高,提取效果最佳,因此選擇甲醇作為樣品超聲提取的溶劑。
3.3.2超聲波提取時間的選擇研究了10～60min不同時間段內,超聲波的提取率。發現30min以上對提取率沒有明顯增大,且隨著超聲時間的延長,會使超聲波儀器內的水溫上升,導致某些易揮發的成分揮發,反而降低了提取率。所以,綜合考慮,選擇30min為超聲提取時間。圖1是24種防腐劑在確定的色譜條件下的液相色譜圖。
3.4線性關系、檢出限、回收率和精密度
在確定的最佳分離色譜條件下,配制一系列不同濃度的混合標準溶液進行色譜測定,以各組分的峰面積(Y)對濃度X(mg/L)繪制標準曲線。當信噪比(S/N)為3時,測得各防腐劑組分的檢出限。各組分的線性方程、相關系數和檢出限。
稱取3種經測定含防腐劑較少,且基線干擾較小的化妝品0.2g(精確到0.001g),分別添加高、中、低3個濃度水平的混合標準溶液,每種樣品重復6次,按上述實驗條件進行樣品處理和測定,計算回收率和精密度。
3.5實際樣品分析
用所建立的檢測方法,對膏霜類、水類和固體類等9個實際化妝品樣品進行測定,以標準樣品色譜圖中各防腐劑的保留時間對化妝品中的防腐劑進行定性,以樣品中各防腐劑色譜峰的峰面積與標準曲線相對應進行定量分析。表4僅列出了9個化妝品中檢測出的9種防腐劑的結果(其余15種防腐劑均未檢出)。從結果可以發現,大多數化妝品中都含有對羥基苯甲酸酯類和苯氧基乙醇,其它種類的防腐劑較少。其中以對羥基苯甲酸甲酯最常見,含量也較高。
綜上所述,采用超聲波提取,高效液相色譜分析,程序可變波長檢測,同時測定化妝品中24種常用防腐劑含量的方法,操作簡便,結果可靠。用于化妝品質量控制,及進出口化妝品檢驗具有重要意義。
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關鍵詞:反相高效液相色譜,化妝品,防腐劑
1引言
化妝品中的防腐劑是為了使化妝品在生產、使用和保存過程中免受微生物污染的一類化妝品添加劑。但大多數防腐劑對人的皮膚會產生不同程度的刺激。因此,化妝品中防腐劑的用量必須以安全性作為前提。我國《化妝品衛生規范》對化妝品中防腐劑的使用濃度和范圍做了相關的規定。目前,國內外對化妝品中防腐劑的測定一般多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質譜法、膠束電動色譜法、毛細管電泳法和伏安法等,而同時測定的防腐劑一般僅為4～8種,最多可同時測定18種,采用的方法均為氣相色譜-質譜法。
本實驗研究了化妝品中的24種常用防腐劑的樣品前處理方法和HPLC分離條件,建立了化妝品中24種常用防腐劑同時檢測的HPLC法。結果表明,本方法簡便、快速、準確,應用于實際化妝品中防腐劑的測定,結果滿意。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀,由四元低壓泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器及自動進樣器組成。
對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、水楊酸、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丁酯及2-芐基-4-氯酚(東京化成工業株式會社);苯甲酸、山梨酸(國家標準物質中心)。乙腈為色譜純,甲醇為優級純;無水乙醇、四氫呋喃等試劑均為國產分析純;Millipore超純水。
2.2標準品混合溶液和供試品溶液的制備
分別準確稱取一定量的24種防腐劑標準品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的標準儲備液。分別移取一定體積的上述標準儲備液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合標準儲備液。準確稱取化妝品0.2g(精確到0.001g)于50mL錐形瓶中,加入10mL甲醇,超聲提取30min,取部分溶液放入離心管中,在離心機上以5000r/min高速離心10min后,取上清液經0.22μm濾膜過濾,濾液供RP-HPLC檢測。
2.3色譜條件
色譜柱:伊利特KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。線性梯度洗脫條件見表1。流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:程序可變波長掃描;進樣量:10μL。
3結果與討論
3.1流動相的選擇
3.1.1緩沖溶液pH的選擇在24種防腐劑中,受pH影響的只有苯甲酸、山梨酸和水楊酸。因此,著重考察了不同pH值(2.5～5.5)對以上3種酸分離情況的影響。發現在pH4.26時,苯甲酸、山梨酸和水楊酸能與溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和對羥基苯甲酸甲酯達到很好的分離,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4濃度的選擇在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液對分離的影響后,發現0.025mol/LNaH2PO4可達到較好的分離,且峰形良好。
3.2檢測波長的選擇
通過全波長掃描可得到24種物質各自的吸收圖譜。綜合各物質在不同波長下的響應值和不同波長對基線的影響,最終確定采用程序可變波長進行掃描,即根據不同組分的出峰順序,在不同時間段,分別用各組分的最佳吸收波長進行檢測,從而提高檢測的靈敏度,達到最佳的掃描效果。
3.3樣品提取方法的選擇
3.3.1樣品提取溶劑的選擇在相同的色譜條件下,比較了甲醇、乙醇、四氫呋喃和流動相等4種溶劑對不同種類化妝品(膏霜類、水類、固體類)的提取效果。結果表明,乙醇和四氫呋喃提取后的色譜圖在2.0～4.5min的色譜峰的峰形欠佳,無法準確計算溴硝丙醇和水楊酸的含量,而流動相提取口紅時,不能將口紅完全溶解,且在28.26min時基線干擾較大,影響被測物質含量的測定。從提取結果可看出,乙醇、四氫呋喃和流動相對某些物質的提取率偏低,而甲醇對各物質的提取率都較高,提取效果最佳,因此選擇甲醇作為樣品超聲提取的溶劑。
3.3.2超聲波提取時間的選擇研究了10～60min不同時間段內,超聲波的提取率。發現30min以上對提取率沒有明顯增大,且隨著超聲時間的延長,會使超聲波儀器內的水溫上升,導致某些易揮發的成分揮發,反而降低了提取率。所以,綜合考慮,選擇30min為超聲提取時間。圖1是24種防腐劑在確定的色譜條件下的液相色譜圖。
3.4線性關系、檢出限、回收率和精密度
在確定的最佳分離色譜條件下,配制一系列不同濃度的混合標準溶液進行色譜測定,以各組分的峰面積(Y)對濃度X(mg/L)繪制標準曲線。當信噪比(S/N)為3時,測得各防腐劑組分的檢出限。各組分的線性方程、相關系數和檢出限。
稱取3種經測定含防腐劑較少,且基線干擾較小的化妝品0.2g(精確到0.001g),分別添加高、中、低3個濃度水平的混合標準溶液,每種樣品重復6次,按上述實驗條件進行樣品處理和測定,計算回收率和精密度。
3.5實際樣品分析
用所建立的檢測方法,對膏霜類、水類和固體類等9個實際化妝品樣品進行測定,以標準樣品色譜圖中各防腐劑的保留時間對化妝品中的防腐劑進行定性,以樣品中各防腐劑色譜峰的峰面積與標準曲線相對應進行定量分析。表4僅列出了9個化妝品中檢測出的9種防腐劑的結果(其余15種防腐劑均未檢出)。從結果可以發現,大多數化妝品中都含有對羥基苯甲酸酯類和苯氧基乙醇,其它種類的防腐劑較少。其中以對羥基苯甲酸甲酯最常見,含量也較高。
綜上所述,采用超聲波提取,高效液相色譜分析,程序可變波長檢測,同時測定化妝品中24種常用防腐劑含量的方法,操作簡便,結果可靠。用于化妝品質量控制,及進出口化妝品檢驗具有重要意義。
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